結論：DNAポリメラーゼは「DNAを伸ばす機能」は同じでも、付属機能が違う5’→3′ / 3’→5′
PCRで使われるDNAポリメラーゼには、さまざまな種類があります。
どのDNAポリメラーゼも、プライマーの3’末端からDNAを5’→3’方向へ伸長するという基本的な働きは共通しています。
しかし、それ以外の機能や得意な反応は同じではありません。
たとえば、
- 間違って取り込んだ塩基を修正できる
→ 3’→5’エキソヌクレアーゼ活性（proofreading・校正活性）
→ エラーが少なく、高正確性（High Fidelity）につながる - DNA合成の進行方向にある核酸を切断できる
→ 5’→3’ヌクレアーゼ活性
→ TaqManプローブの切断などに利用される - PCR開始前には働かないようにできている
→ Hot Start
→ 非特異的増幅やプライマーダイマーを抑えやすい - 長いDNAや増幅しにくい配列にも対応できる
→ DNAポリメラーゼ自体の伸長性能や、バッファー・添加剤など反応系の工夫
このように、同じ「DNAポリメラーゼ」でも持っている機能や得意分野が異なります。
この記事では、Taq DNAポリメラーゼとKOD DNAポリメラーゼの違いも例にしながら、PCR用DNAポリメラーゼのカタログやプロトコルでよく出てくる専門用語を整理します。
紛らわしい！「○○活性」に注意
PCR用DNAポリメラーゼについて調べていると、次のような「○○活性」という言葉が出てきます。
単語がとにかく紛らわしいので、まず先に整理します。
5’→3′ DNAポリメラーゼ活性は、PCRの伸長反応で塩基を取り込み、DNAを合成する働きです。
一方、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性は、DNA合成の進行方向にある核酸を切断する働きです。
これは、DNA合成の進行方向に存在する核酸、つまり下流側（downstream）の核酸を切断できる活性です。
本記事では分かりやすく「前方の核酸を切る」と表現します。
そして、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性は、DNA合成中に誤って取り込んだ塩基を3’末端側から取り除く働きです。これはproofreading（校正）に関係します。
特に紛らわしいのが、
- 5’→3′エキソヌクレアーゼ活性
- 3’→5′エキソヌクレアーゼ活性
で、よく見ると数字の方向が逆になっています。
私は最初よく読み間違えて、まるで間違い探しのようでした。
まずは、
ポリメラーゼ → 作る
ヌクレアーゼ → 切る
さらにエキソヌクレアーゼ活性は、
5’→3′ → 前方を切る
3’→5′ → 戻って校正する
と覚えておくと整理しやすくなります。
では、すべてのDNAポリメラーゼが、この3つの活性を持っているのでしょうか。
実は、そうではありません。
DNAを5’→3’方向へ合成する基本的な働きは共通していますが、どのヌクレアーゼ活性を持っているかはDNAポリメラーゼによって異なります。
その代表例が、Taq DNA polymeraseとKOD DNA polymeraseです。
ここからは、市販製品である**AmpliTaq Gold（Thermo Fisher Scientific）とKOD FX Neo（東洋紡）**も例にしながら、両者の違いを見ていきます。
5’→3′ エキソヌクレアーゼ活性とは？
Taq DNA polymeraseは、5’→3′ エキソヌクレアーゼ活性を持っています。
これは、DNA合成の進行方向に存在する核酸を切断できる活性です。
この性質をうまく利用したものの一つが、TaqManプローブを使用したリアルタイムPCRやddPCRです。
鋳型DNA上にTaqManプローブが結合していると、DNAを伸長してきたTaqがプローブに到達します。
すると5’→3′ エキソヌクレアーゼ活性によってプローブが切断され、レポーターとクエンチャーが離れて蛍光が検出されます。
ここで重要なのは、Taqが「TaqManプローブを切るために」この活性を持っているわけではないということです。
Taqがもともと持っている5’→3′ エキソヌクレアーゼ活性を、TaqMan法が蛍光検出に利用しています。
つまり、5’→3′ エキソヌクレアーゼ活性はプローブPCR専用の機能ではありません。
Taq DNA polymeraseは、DNAを5’→3’方向へ合成するという本来のDNAポリメラーゼ活性を持っているため、プローブを使用しない通常のPCRにも使用できます。
通常のPCRで使用される製品の一つが、AmpliTaq Gold（Thermo Fisher Scientific）です。
なお、Taq DNA polymeraseは5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を持つ一方、校正に関わる3’→5’エキソヌクレアーゼ活性（proofreading活性）は持っていません。
Taq DNA polymeraseについては、こちらの記事で詳しく解説しています。
👉 Taq DNAポリメラーゼとDNAポリメラーゼの違いとは？
👉 ddPCRで使われる蛍光プローブとは？蛍光が出る仕組みをわかりやすく解説
3’→5’エキソヌクレアーゼ活性（proofreading）とは？
proofreadingは、直訳すると「校正」です。
文章を書いたあとに誤字を見つけて直すように、DNAポリメラーゼが自分で合成したDNAをチェックし、間違って取り込んだ塩基を取り除く働きを指します。
このproofreadingに重要なのが、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性です。
DNAポリメラーゼは、DNAを5’→3’方向に伸長します。
もし一番新しく取り込んだ3’末端の塩基が間違っていた場合、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を持つDNAポリメラーゼは、その塩基を取り除くことができます。
そして再び正しい塩基を取り込み、DNA合成を続けます。
つまり、
DNAを作る → 間違える → 戻って削る → 正しく作り直す
ということができます。
この校正機能によってDNA合成時のエラーを減らすことができ、高い正確性（High Fidelity）につながります。
Fidelityとは、DNAポリメラーゼが鋳型DNAの配列をどれだけ正確にコピーできるかを表します。
DNAポリメラーゼも、必ず正しい塩基だけを取り込むわけではありません。
DNAを合成している途中で、誤った塩基を取り込むことがあります。
しかし、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を持っていると、校正機能によりDNAを正確にコピーしやすくなります。
この3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を持つDNAポリメラーゼの一つが、KOD DNA polymeraseです。
KOD DNA polymeraseを利用したPCR製品には、**KOD FX Neo（東洋紡）**などがあります。
KOD DNA polymeraseとは？Taqとは何が違う？
KOD DNA polymeraseは、超好熱性アーキア Thermococcus kodakarensis に由来する耐熱性DNAポリメラーゼです。
Taq DNA polymeraseと同じようにDNAを5’→3’方向へ合成できますが、両者は同じ種類のDNAポリメラーゼではありません。
Taq DNA polymeraseはFamily A、KOD DNA polymeraseはFamily Bという異なるグループに分類されます。
DNAポリメラーゼの「ファミリー」とは、構造やアミノ酸配列、進化的な関係などをもとにDNAポリメラーゼを分類したグループのことです。
つまり、TaqとKODはどちらも「DNAを合成する」という仕事は同じですが、そもそも別グループの酵素です。
そのため、持っている付加的な機能にも違いがあります。
つまり、
- Taq：DNAを作れる＋前方の核酸を切れる
- KOD：DNAを作れる＋間違えた塩基を戻って削れる
という違いがあります。
同じ「DNAポリメラーゼ」という名前でも、DNAを合成する基本的な機能が共通しているだけで、それ以外の機能まで同じとは限りません。
これが、PCRで目的に応じて異なるDNAポリメラーゼが使い分けられる理由の一つです。
また、KOD DNA polymeraseは校正活性だけでなく、DNAから離れずに連続して塩基を取り込む能力（processivity）が高いことも特徴です。
KOD FX Neoとは？
KOD FX Neo（東洋紡）は、KOD DNA polymeraseをベースにしたPCR酵素です。
KODの3’→5’エキソヌクレアーゼ活性（proofreading活性）を持つため、Taq DNA polymeraseよりも高い正確性（High Fidelity）を持っています。
PCR産物の塩基配列をできるだけ正確に保ちたい場合には、High Fidelityを特徴とするDNAポリメラーゼが選択肢になります。
しかし、KOD FX Neoの特徴は正確性だけではありません。
微量なDNAでも増幅しやすく、長いDNAやGC-richなどの増幅しにくいターゲットにも強いという特徴があります。
実際、KOD FX Neoは従来品より検出感度が向上しており、微量の鋳型DNAからの増幅にも対応しています。
感度が高いのは便利ですが、微量なDNAでも増幅できるということは、目的ではないDNAが混入した場合にも注意が必要です。
PCRでは、試薬へのDNAの持ち込みや過去のPCR産物の混入などを防ぐため、コンタミネーション対策も重要になります。
つまりKOD FX Neoは、
「間違いを校正できる」だけでなく、「少ない・長い・増えにくいDNAも増幅しやすい」PCR酵素
と考えると特徴をつかみやすいでしょう。
Hot Startとは？
Hot Startも、PCR用DNAポリメラーゼの製品情報でよく見かける言葉です。
Hot Startとは、PCR反応液を調製している段階ではDNAポリメラーゼの活性を抑えておき、PCR開始時の加熱によって活性化する仕組みです。
反応開始前にプライマーが目的とは異なる場所へ結合すると、非特異的なDNA合成が起こる可能性があります。
そこでDNAポリメラーゼをあらかじめ不活性化しておき、PCR開始後に働かせることで、非特異的増幅やprimer dimerを抑えます。
代表例の一つがAmpliTaq Goldです。
AmpliTaq GoldはTaq DNA polymeraseをベースとしたHot Start酵素で、化学修飾によって酵素活性が抑えられています。
PCR開始時の加熱によって活性化され、DNA合成が可能になります。
なお、
Hot Start＝非特異的な反応を抑える仕組み
proofreading＝合成したDNAの間違いを修正する仕組み
です。
似たように「PCRを良くする機能」に見えますが、目的はまったく異なります。
酵素のU（unit）とは？
PCRのプロトコルを見ると、
「1 U」
「2.5 U」
「5 U/µL」
といった表記が出てきます。
U（unit）は酵素の重さを表しているわけではありません。
酵素がどれくらい反応を進められるかを表す「酵素活性」の単位です。
つまり、
µg・mg → 酵素の質量
U → 酵素がどれくらい働けるか
を表します。
一般的な酵素では、一定条件下で1分間に1 µmolの基質を変化させる酵素量を1 Uと定義する場合があります。
ただし、Uの具体的な定義は酵素によって異なります。
DNAポリメラーゼの場合も、メーカーが規定した反応条件で一定時間に一定量のヌクレオチドをDNAへ取り込む活性などをもとに定義されています。
そのため、異なる製品を単純に「同じ1 Uだから同じ量の酵素」と考えることはできません。
たとえば5 U/µLのDNAポリメラーゼを1 reactionあたり1 U使用する場合、
1 U ÷ 5 U/µL ＝ 0.2 µL
を添加します。
PCRプロトコルに書かれているUは、「酵素を何µg入れるか」ではなく、「必要な酵素活性をどれくらい入れるか」を示しているのです。
PCR用DNAポリメラーゼの専門用語まとめ
PCR用DNAポリメラーゼのカタログにはさまざまな専門用語が登場しますが、それぞれ別の性質を表しています。
DNAポリメラーゼの製品名だけを覚えても、なぜその酵素を使用するのかはなかなか分かりません。
しかし、
「この酵素にはどんな活性があるのか？」
「その活性がPCRでどんな役割を果たしているのか？」
という視点でカタログを見ると、それぞれのDNAポリメラーゼの違いが少しずつ見えてきます。
TaqとKODも、どちらもDNAを合成するDNAポリメラーゼですが、持っている付加的な活性が異なります。
その違いを知ることが、PCR用DNAポリメラーゼを理解する第一歩です。
