変異を含む領域をPCRで増幅してサンガーシーケンスを行う場合には、変異がどのexonに存在するのかを確認することがあります。
変異を含むexonが分かれば、PCRで増幅する領域を検討するための手がかりになります。
今回はTP53の
NM_000546.6:c.574C>T
を例に、NCBIを使って変異がどのexonに含まれるのか調べてみます。
ただし、ここで一つ注意があります。
実は「何番exonか」という番号には、数え方の違いがあります。
今回は実際にNCBIを調べながら、その違いについても確認してみます。
今回調べる変異
今回使用するのは、TP53の次の変異です。
NM_000546.6:c.574C>T
- NM_000546.6：今回、変異位置を調べるときに基準として使うmRNA
- c.574：CDSの開始位置（c.1）を基準とした574番目の塩基
- C>T：CからTへの塩基置換
遺伝子のDNAにある情報は、RNAに転写されます。
そして、1つの遺伝子から作られるmRNAは、必ずしも1種類だけではありません。
TP53にも複数のmRNAがあり、今回使用するNM_000546.6はその一つです。
このように、DNAから転写されて作られるRNAをtranscript（転写産物）と呼びます。
今回は、このc.574がmRNA上のどこにあり、どのexonに含まれるのかをNCBIで調べていきます。
c.574はmRNAの716番目
前回の記事で確認したように、NM_000546.6:c.574C>Tの変異位置は、mRNA上の716番目に相当します。
「なぜc.574が716番目になるの？」という方は、こちらの記事で詳しく解説しています。
👉遺伝子変異の場所の見つけ方｜NCBIでc.表記から塩基位置を調べてみよう
今回は、この716番目がどのexonに含まれるのかを調べていきます。
mRNAの716番目を含むexonを探す
それでは、実際にNCBIを開いて一緒に調べてみましょう。
👉 NCBI Nucleotide：NM_000546.6
今回は、NM_000546.6のGenBank画面を使って確認していきます。
GenBank画面でexonを検索すると、NM_000546.6を構成するexonの範囲を確認できます。
exonの右横に表示されている数字は、NM_000546.6というmRNA上で、それぞれのexonがどの範囲に相当するのかを表しています。
例えば、オレンジでハイライトしたexonには、
exon 1..114
と表示されています。
これは「exon 1」という意味ではなく、1番目のexonがmRNA上の1～114番目の塩基に相当することを表しています。
今回探しているのは716番目です。
GenBankを見ると、
というexonがあります。
716は702～814の範囲に含まれるため、変異はこのexonに存在することが分かります。
さらに、GenBankに表示されているexonを上から数えると、このexonは6番目です。
つまり、NM_000546.6というtranscript上で、変異を含むのは上から6番目のexonであることが分かります。
「6番目のexon」と「coding exon 5」は数え方が違う
NCBIにはさまざまなデータベースがあり、同じ遺伝子や変異について調べても、データベースによって異なる角度からの情報を確認できます。
これまで使用してきたNCBI Nucleotideでは、塩基配列やCDS、exonなど、配列そのものの情報を確認できます。
一方、ClinVarでは、特定の遺伝子変異について、疾患との関係や臨床的な評価などの情報を確認できます。
同じNM_000546.6:c.574C>Tを、今回はClinVarで調べてみます。
ClinVar：NM_000546.6(TP53):c.574C>T
ClinVarのページを下にスクロールすると、この変異について登録された詳しい説明を見ることができます。
ClinVarのページでも、同様にexonで検索してみます。
すると、変異についての説明の中に、
coding exon 5
という記載が見つかります。
つまりClinVarでは、この変異について「coding exon 5に位置する」という説明が登録されています。
※この説明は、ClinVarにAmbry Geneticsという遺伝子検査会社から登録された情報です。
ここで少し不思議なことが起こります。
先ほどGenBankでは、変異を含むexonは上から6番目でした。
ところが、ClinVarではcoding exon 5。
6番目なのに、なぜ「coding exon 5」なのでしょうか？
「6番目のexon」と「coding exon 5」は矛盾しない
もう一度、NM_000546.6のCDSを確認してみます。
CDS 143..1324
一方、最初に表示されるexonは、NM_000546.6のmRNA上の1～114番目に位置します。
exon 1..114
です。
つまり、最初のexonにはCDSが含まれていません。
次のexonは、mRNA上の115～216番目に位置します。
exon 115..216
です。
CDSは143番目から始まるため、このexonの途中からCDSが始まります。
模式的にすると、
となります。
そこで、今回のNM_000546.6について、CDSを含むexonだけを上から数えてみると、
exon 1..114 → CDSを含まない
exon 115..216 → coding exon 1
exon 217..238 → coding exon 2
exon 239..517 → coding exon 3
exon 518..701 → coding exon 4
exon 702..814 → coding exon 5 ←c.574となります。
つまり今回のNM_000546.6について、変異を含むexonは、
NM_000546.6上で上から数えると6番目
ですが、
今回の変異では、CDSを含むexonだけを数えると5番目になります。
実際にClinVarを見ると、この変異について登録された情報にも「coding exon 5」と記載されています。
そのため、GenBankで確認した「6番目のexon」と、ClinVarに登録されている「coding exon 5」は矛盾していません。
※exonには、タンパク質に翻訳される領域だけでなく、翻訳されない領域が含まれる場合もあります。この仕組みについては別の記事で詳しく解説します。
では、どちらが「正しいexon番号」なの？
ここが今回、一番重要なところです。
何を基準にしたexon番号なのかによって、表現が変わることがあります。
そのため、
この変異はexon 5です
あるいは、
この変異はexon 6です
という番号だけを見て判断するのは危険です。
遺伝子からmRNAが作られるとき、1つの遺伝子から複数種類のmRNAが作られることがあります。
このようなmRNAの違いによって、exonの構成が異なる場合があります。
そのため、exon番号を確認するときには、
どのtranscriptを基準にしているのか？
を確認することが重要です。
今回であれば、
NM_000546.6
というtranscriptを基準にして調べています。
例えば、与えられた変異情報が、
TP53 exon 5
だけでは、どのtranscriptや、どの数え方を基準にしたexon番号なのか分からない場合があります。
そのため、変異の位置を確認するときには、「exon ○番」という番号だけでなく、基準となるtranscriptや変異表記も一緒に確認することが重要です。
そもそも、なぜ変異がどのexonにあるのか調べるの？
ここまで、変異がどのexonに含まれるのかを調べてきました。
では、そもそも何のためにexonを確認するのでしょうか。
exonは、長い遺伝子の中で変異が存在する領域を把握するための目印になります。
例えば、「○○町」とだけ言われるより、「東京都○○区○○町」と言われたほうが、場所を絞り込みやすくなります。
遺伝子も同じように、変異を含むexonが分かれば、どの領域を調べればよいのかを絞り込むことができます。
サンガーシーケンスで変異を確認する場合には、
transcriptを確認
↓
変異位置を確認
↓
変異を含むexonを確認
↓
PCRで増幅する領域を決める
↓
使用するプライマーを決める
↓
PCR
↓
サンガーシーケンスという流れで考えることができます。
すでにexonごとのプライマーが用意されている場合には、変異を含むexonを確認することで、使用するプライマーを選ぶ手がかりにもなります。
一方、適したプライマーがない場合には、新たにプライマーを設計することもあります。
実際のプライマー設計では、目的や配列条件に応じて、変異を含むexonの前後のintronなどにプライマーを設計し、目的のexonを含む領域を増幅することがあります。
まとめ
今回は、NM_000546.6:c.574C>Tを例に、NCBIを使って変異がどのexonに含まれるのか調べました。
c.574はNM_000546.6のmRNA上の716番目に相当し、上から数えると6番目のexonに含まれます。
一方、ClinVarでは同じ変異について「coding exon 5」という記載があります。
これは、何を基準にexonを数えるかによって、番号の表現が異なることがあるためです。
そのため、変異の位置を確認するときには、
「exon ○番」という番号だけで判断せず、どのtranscriptを基準にしているのかを確認することが重要です。
サンガーシーケンスで変異を確認する場合には、変異を含むexonを確認することで、PCRで増幅する領域を考えるための手がかりになります。
