【結論】プライマー設計では「条件に合うか」と「目的に合うか」を見る
PCRで使うプライマーは、ただ目的の配列に合っていれば良いわけではありません。
プライマー設計では、主に次の項目を確認します。
- プライマーの長さ
- Tm値
- Forward primerとReverse primerのTm値の差
- GC含量
- 3’末端
- プライマー同士の相性
- 目的領域をきちんとはさんでいるか
短すぎてもダメ。
長すぎてもダメ。
強くくっつきすぎても、弱すぎても上手く増えません。
プライマー設計では、PCRに適した条件を満たしているか、そして自分が見たい領域をきちんと増やせるかを確認します。
この記事では、初心者向けに「まずここを見ればOK」というプライマー設計の基本項目を解説します。
プライマーとは何か
プライマーとは、PCRでDNA合成を始めるための短いDNAです。
DNAポリメラーゼは、何もないところから突然DNAを作り始めることはできません。
すでにある短いDNAの端、つまりプライマーの3’末端から、新しい塩基をつなげていきます。
PCRでは、通常Forward primerとReverse primerの2本を使います。
この2本が、増やしたい領域の両端にくっつきます。
そして、DNAポリメラーゼがそれぞれのプライマーの3’末端からDNAを伸ばすことで、目的の領域が増幅されます。
プライマーは自分で作るの？
プライマー設計という言葉だけを見ると、「実験室でプライマーを自分で作るのかな？」と思うかもしれません。
しかし、通常のPCR用プライマーは、実験室で自分で作るのではありません。
専門の会社に合成を依頼します。
研究者や検査担当者が行うのは、プライマーそのものを作ることではなく、
プライマーの配列を決めることです。
たとえば、
Forward primer：5’-ATGCTACCGTTAAGC-3’
Reverse primer：5’-GCTTAACGGTAGCAT-3’
のように、Forward primerとReverse primerの配列を決めます。
その配列を注文画面に入力したり、注文用のファイルに記入したりして、業者に合成してもらいます。
PCRではForward primerとReverse primerをセットで使いますが、注文するときは、それぞれ別々のプライマーとして依頼します。
一般的なPCR用プライマーであれば、価格は1本あたり数百円〜千円台程度のことが多いです。
つまり、Forward primerとReverse primerを両方頼む場合は、2本分の費用がかかります。
もちろん、蛍光標識や特殊な修飾をつける場合、精製グレードを上げる場合などは、価格が高くなります。
初心者向けには、まず、
プライマー設計とは、プライマーを自分で合成することではなく、
業者に注文するための配列を決めること
と考えるとわかりやすいです。
プライマー設計はツールを使うことが多い
プライマー設計は、1塩基ずつ手で考えて作るというより、実際には専用のツールを使うことが多いです。
調べたいDNA配列をツールに入力すると、ツールはその配列の中から、条件に合いそうなForward primerとReverse primerの組み合わせを提案してくれます。
ツールは、たとえば次のような項目を見ています。
- プライマーの長さ
- Tm値
- GC含量
- PCR産物の長さ
- プライマー同士がくっつきやすくないか
- 目的外の場所にも結合しにくいか
ただし、ここで大事なのは、ツールが出すのはあくまで候補だということです。
ツールは便利ですが、「この実験で何を確認したいのか」までは完全には判断できません。
たとえば、病気に関係する変異を確認したい場合、見たい変異がPCR産物の中に入っていなければ意味がありません。
そのため、ツールで候補を出した後に、
見たい場所をちゃんとはさんでいるか
長さやTm値が極端ではないか
3’末端が変な位置にないか
目的外のPCR産物が出にくそうか
を人間が確認します。
プライマー設計は、ツールに候補を出してもらい、人間が目的に合っているか確認する作業と考えるとよいです。
プライマーの長さはどのくらいが多い？
プライマーの長さは、一般的には18〜25塩基くらいがよく使われます。
初心者向けには、まず20塩基前後をイメージするとわかりやすいです。
短すぎると、似た配列にもくっつきやすくなります。
たとえば、住所でいうと「東京都」だけしか書いていないようなものです。
これでは、目的地を特定しきれません。
一方で、長すぎると、Tm値が高くなりすぎたり、プライマー自身の中でくっつきやすくなったりして、扱いにくくなることがあります。
つまり、プライマーには、
目的地を間違えない程度に、ちょうどよく特定する長さが必要です。
Tm値とは何か
Tm値は、プライマーがターゲットDNAにどのくらいくっつきやすいかを、温度で表した目安です。正式には、融解温度、melting temperature と呼ばれます。
Tm値は、プライマーとターゲットDNAが作る二本鎖の半分がほどけて、一本鎖に分かれる温度です。
ここでいう「半分」とは、1本のDNAが半分だけほどけるという意味ではありません。
溶液全体で見たときに、二本鎖として結合しているものと、一本鎖に分かれたものが半分ずつくらいになる、という意味です。
PCRでは、アニーリングという工程でプライマーがターゲットDNAにくっつきます。
このアニーリング温度を考えるときに、Tm値が目安になります。
温度が高すぎると、プライマーはターゲットDNAにくっつきにくくなります。
一方で、温度が低すぎると、目的以外の似た配列にもくっつきやすくなります。
そのため、プライマー設計ではTm値を確認します。
Tm値が高いプライマーは、その条件では二本鎖を保ちやすく、外れにくいプライマーです。
逆に、Tm値が低いプライマーは、二本鎖がほどけやすく、外れやすいプライマーです。
一般的には、55〜65℃くらいがよく使われます。
ただし、実際のTm値は、配列、長さ、GC含量、塩濃度、プライマー濃度、使用する酵素やバッファー条件によって変わります。
Forward primerとReverse primerのTm値はなぜ近い方がいい？
PCRでは、Forward primerとReverse primerの2本を同じ反応液の中で使います。
つまり、この2本は同じアニーリング温度で働く必要があります。
そのため、Forward primerとReverse primerのTm値は、できるだけ近い方がよいです。
一般的には、±2〜3℃以内くらいが目安として使われることが多いです。
たとえば、
Forward primer：60℃
Reverse primer：50℃だったとします。
この場合、60℃に合わせると、Reverse primerがくっつきにくくなります。
逆に、50℃に合わせると、Forward primerが目的以外の場所にもくっつきやすくなるかもしれません。
つまり、片方にはちょうどよくても、もう片方には合わない条件になってしまうのです。
イメージとしては、2人で縄跳びをするのに、1人は全力疾走、もう1人はゆっくり歩いているようなものです。
これではタイミングが合いません。
PCRでも同じで、Forward primerとReverse primerは、似た条件で働けるようにしておく必要があります。
GC含量とは何か
GC含量とは、プライマーの中にGとCがどれくらい含まれているかを表す割合です。
たとえば、20塩基のプライマーの中にGとCが合わせて10個あれば、GC含量は50％です。
20塩基中、G+Cが10個
↓
GC含量 50％DNAでは、AはTと、GはCと結合します。
A - T
G - Cこのうち、G-Cの結合はA-Tよりも安定しやすいです。
そのため、GC含量が高いプライマーは、ターゲットDNAと二本鎖を保ちやすくなります。
一方で、GC含量が低すぎると、結合が弱くなりやすく、プライマーが外れやすくなります。
一般的な目安は、40〜60％くらいです。
ただし、GCが多すぎてもよいわけではありません。
GCが多すぎると、結合が強くなりすぎたり、プライマー同士やプライマー自身の中でくっつきやすくなったりすることがあります。
また、プライマーの3’末端は、GまたはCで終わるとよいと言われることがあります。
これは、DNAポリメラーゼが伸長を始める3’末端が安定しやすくなるためです。
ただし、3’末端側にGやCが連続しすぎると、目的外の伸長につながることもあります。
そのため、3’末端はG/Cだと安定しやすいが、GCが多すぎるのもよくない
と考えるとよいです。
ここでも大事なのは、ちょうどよさです。
塩基配列についてはコチラの記事で解説しています。
👉DNA配列とは？｜A・T・G・Cとbpを超初心者向けに解説
なぜ3’末端が大事なのか
プライマー設計では、特に3’末端が大事です。
プライマーは、通常5’→3’方向で書きます。
たとえば、次のようなプライマーがあるとします。
5’-ATGCTACCGTTAAGC-3’
この場合、右端のCが3’末端です。
5’-ATGCTACCGTTAAGC-3’
↑
3’末端
DNAポリメラーゼは、この3’末端から新しい塩基をつなげていきます。
つまり、3’末端はDNA合成のスタート地点です。
プライマー全体がターゲット配列に合っていることも大切ですが、特に最後の数塩基、つまり3’末端側にミスマッチがないかを確認することが重要です。
5’側に多少のミスマッチがあっても、PCRが進むことはあります。
しかし、3’末端にミスマッチがあると、DNAポリメラーゼがうまく伸長を始められません。
そのため、3’末端のミスマッチは、増幅不良の原因になりやすいです。
イメージとしては、プライマーは新幹線の始発駅のようなものです。
線路がだいたい合っていても、発車するホームがズレていたら、うまく出発できません。
それくらい、3’末端は重要です。
3’末端がマッチしているか確認する方法
3’末端がマッチしているかを見るときは、プライマーの最後の塩基が、ターゲット配列と正しく対応しているかを確認します。
たとえば、プライマーの3’末端がCなら、ターゲット側にはGがある必要があります。
プライマー末端：C
ターゲット側：Gこれなら、3’末端はマッチしています。
ただし、実際のプライマー設計では、Forward primerとReverse primerの向きや相補鎖の考え方で混乱しやすいです。
特にReverse primerは、手作業で確認すると向きを間違えやすいため、Primer-BLASTなどのツールを使って、狙った場所に正しい向きで結合しているか確認すると安心です。
Reverse primerと逆相補配列の考え方については、別の記事で詳しく解説しています。
👉プライマーの超入門｜Reverse primerと逆相補配列をやさしく解説
プライマー同士がくっつくと困ることがある
プライマー設計では、プライマー同士がくっつきやすくないかも確認します。
特に注意したいのは、Forward primerとReverse primerの3’末端同士が相補的になっている場合です。
少し相補的な部分があるだけで全部ダメ、というわけではありません。
問題になりやすいのは、3’末端側に連続して相補的な配列がある場合です。
DNAポリメラーゼは、プライマーの3’末端からDNAを伸ばします。
そのため、プライマー同士の3’末端がくっついてしまうと、片方のプライマーを鋳型として、もう片方のプライマーが伸長されることがあります。
このようにしてできる短いDNA産物を、プライマーダイマーといいます。
プライマーダイマーは目的のDNAではないため、PCRの邪魔になることがあります。
詳しくは、次の記事で解説します。
目的領域をきちんとはさんでいるか
プライマーは、見たい場所そのものに置くというより、見たい場所をはさむように設計します。
たとえば、病気に関係する変異を確認したい場合、変異そのものにプライマーを置くのではなく、変異の少し外側にForward primerとReverse primerを置きます。
Forward primer → 変異部位 ← Reverse primer
こうすることで、変異を含む領域をPCR産物の中に入れることができます。
特に注意したいのは、プライマーの3’末端が変異部位に重ならないようにすることです。
3’末端が変異部位にかかっていると、片方の配列にはくっつきやすいけれど、もう片方にはくっつきにくい、ということが起こる場合があります。
その結果、本当は変異があるのに、変異を含むDNAがうまく増えない可能性があります。
そのため、変異確認用のプライマーでは、見たい変異を直接プライマーに乗せるのではなく、変異を少し外側からはさむように設計します。
とはいえ、最後は増やしてみないとわからない
ここまで、プライマー設計で見るべき項目を説明してきました。
しかし、プライマー設計ツールで条件を確認しても、PCRが必ずうまくいくとは限りません。
実際のPCRでは、
- 鋳型DNAの状態
- 配列の特徴
- アニーリング温度
- 使用する酵素
- 反応液の条件
- サイクル数
など、いろいろな条件が影響します。
そのため、設計上はよさそうに見えたプライマーでも、実際にPCRをしてみると目的バンドが出ないことがあります。
逆に、少し心配な候補でも、条件を調整するときれいに増えることもあります。
PCRは、設計して終わりではありません。
設計する
↓
増やしてみる
↓
電気泳動で確認する
↓
必要なら条件やプライマーを変える
この試行錯誤をしながら、目的の産物がきれいに増える条件を探していきます。
ツールで設計したのにうまくいかないと、「自分が何か大きく間違えたのかな」と思うかもしれません。
でも、PCRはもともと試行錯誤が多い実験です。
大事なのは、なぜうまくいかなかったのかを考えながら、条件を一つずつ確認していくことです。
初心者向け｜まず見るべき設計条件
迷ったら、まずは次の項目を確認します。
まずはこの条件を満たしているかを見るだけでも、PCRが失敗しにくいプライマーに近づきます。
ただし、これらはあくまで目安です。
最終的には、実際にPCRをして、目的の産物がきれいに増えるかを確認します。
まとめ
プライマーを設計するときは以下を確認しましょう。
- プライマーはPCRでDNA合成を始めるための短いDNA
- プライマーは通常5’→3’方向で書く
- プライマーは自分で作るのではなく、配列を決めて業者に合成してもらう
- Forward primerとReverse primerは別々に注文する
- 長さは18〜25塩基くらいがよく使われる
- Tm値はプライマーのくっつきやすさに関係する
- Forward primerとReverse primerのTm値は近い方がよい
- GC含量は高すぎても低すぎても注意
- 3’末端はDNAポリメラーゼが伸長を始める場所
- プライマー同士の3’末端が相補的だと、プライマーダイマーの原因になる
- 目的領域をはさむようにプライマーを置く
- とはいえ、最後は増やしてみないとわからない
- PCRは試行錯誤しながら条件を決めていく実験
プライマー設計は、PCRの入口です。
ここを理解しておくと、PCRがうまくいかなかったときにも、どこを見直せばよいのか考えやすくなります。
