「DNA抽出したらA260/A280が0.8だった…」
「1.8が良いって聞くけど、なぜ1.8なの？」
「細胞はたくさんあるはずなのに、なぜ純度が悪いの？」
DNA抽出後、NanoDropで濃度や純度を測ると、
思ったより数値が悪くて戸惑うことがあります。
実は、DNAは“多すぎても”純度が悪くなることがあります。
私自身も、全血からDNA抽出した際に A260/A280が0.8程度 しか出ず驚いたことがあります。ところが、検体をPBSで希釈して再抽出すると、約1.8まで改善 しました。
この記事では、「A260/A280はなぜ1.8くらいがいいのか？」という基本から、A260/A280・A260/A230の意味、純度低下の原因、現場での考え方まで初心者向けに解説します。
DNA抽出後は、濃度と純度を確認する
DNA抽出後、多くの現場では NanoDrop（ナノドロップ） などを使って、
DNA濃度 と 純度を確認します。
濃度は、DNAがどれくらい取れたか（量）を見るためのものです。
単位はよく ng/µL（ナノグラム/マイクロリットル） が使われます。
一方、純度は、DNA以外のものがどれくらい混ざっているかを見る指標です。
代表的なのが、
- A260/A280
- A260/A230
です。
ちなみに、A260の「A」は Absorbance（吸光度）の略です。つまり、A260とは「260nmでどれくらい光を吸ったか」を表しています。古い資料や実験室では「O.D.（Optical Density）」と書かれることもありますが、A260とOD260は、どちらも260nmでの吸光度を意味します。
A260/A280、A260/A230とは？
DNAは、260nm の波長の光をよく吸収します。
一方で、
- タンパク質 → 主に 280nm
- 抽出試薬・塩類・糖など → 主に 230nm
付近の光を吸収します。
そのため、DNAの吸光度である A260 を、A280やA230で割ることで、DNAに対して不純物がどれくらい混ざっているかを推測できます。
A260/A280
A260/A280 = 260nmの吸光度 ÷ 280nmの吸光度
これは、主に タンパク質混入の目安 になります。
タンパク質が多く混ざると280nmの吸光が増えるため、A260/A280は低下します。
A260/A230
A260/A230 = 260nmの吸光度 ÷ 230nmの吸光度
これは、主に 抽出試薬・塩類・糖などの混入の目安 になります。
230nm付近では、フェノール、グアニジン塩、EDTA、糖、多糖類、エタノール残りなどが影響することがあります。
つまり、分母であるA280やA230の吸光が大きくなるほど、A260/A280やA260/A230の値は低くなります。
これは、DNAそのものが少ないというより、
DNAに対して不純物が相対的に多い状態を意味します。
余談ですが、230nm、260nm、280nmはいずれも人間の目には見えない 紫外線領域の光 です。
純度の目安
一般的な目安は次の通りです。
これらを測定することで、現場では、
DNAがきれいか？
試薬が残っていないか？
をまとめて確認しています。
もし一般的な目安から外れていた場合は、タンパク質や抽出試薬などの不純物混入を疑います。
ただし、数値だけで「失敗」と判断するわけではありません。
実際には、純度が少し低くても PCRが問題なく通ること はあります。
逆に、数値がきれいでも 増幅しないこと もあります。
そのため現場では、
「数値は参考、最終的にはPCRで判断」
という考え方をすることも少なくありません。
なぜDNAの純度は「1.8」が目安なの？
一般的に、DNAのA260/A280は1.8前後が理想と言われます。
これは、純粋な二本鎖DNAそのものが、A260/A280で約1.8付近になる性質を持っているためです。
ここで大事なのは、吸光度そのものが決まっているわけではないということです。
例えば、
DNA濃度が高ければ、
- A260 → 高い
- A280 → 高い
になります。
逆にDNA濃度が低ければ、どちらも低くなります。
ただし、純粋なDNAなら、260nmと280nmの“比率”はだいたい一定です。
例えば、
- A260 = 0.90
- A280 = 0.50
なら、0.90 ÷ 0.50 = 1.80になります。
つまり、「標準的にきれいなDNAなら、だいたい1.8前後になる」という考え方です。
ただし、1.80ぴったりでなければダメではありません。
施設や機器、濃度、ブランク条件でも多少変動します。
A260/A230が目安に入らなかったときに疑われること
230nm付近では、主に次のようなものが影響します。
- フェノール
- グアニジン塩（抽出試薬）
- EDTA
- 一部の有機溶媒
- エタノール残り
- 糖・多糖類
例えば、wash bufferが十分除去できていなかったり、乾燥不足でエタノールが残ったりすると、A260/A230が低下することがあります。
糖や多糖類が残ると、230nm付近の吸光が高くなり、A260/A230が低下することがあります。特に植物や食品など、多糖類を多く含む検体では注意が必要です。
また、極端に高い場合は、ブランク不一致や低濃度による測定誤差なども考えます。
A260/A280が目安に入らなかったときに疑われること
280nm付近では、主にタンパク質が影響します。
A260/A280が低い原因
タンパク質が混ざっている
最も多い原因です。
細胞を壊すと、DNAだけではなく、
- 細胞膜成分
- 核タンパク
- ヘモグロビン
- 細胞内タンパク
も出てきます。
これらが十分除去できないと、280nmの吸光が増え、A260/A280は低下します。
DNA量（細胞量）が多すぎるとどうなる？
意外ですが、検体が多すぎても、純度が悪くなることがあります。
その理由は抽出系の処理能力（バッファー量・カラム結合能・洗浄能力）を超えることで、タンパク質などの不純物が十分除去できなくなることがあるからです。
その結果、A260/A280が低下することがあります。
特に、
- 全血
- 顆粒球
- 白血球数が多い検体
では起こりやすいです。
実務で経験したこと：検体が濃すぎても純度が悪くなることがある
以前、全血からDNAを抽出した際に、A260/A280が0.8程度 しか出なかったことがありました。
「血液なら細胞が多いし、DNAはたくさん取れるはずなのに……」
と不思議に思いました。
先輩に相談すると、
「血液が濃すぎて、抽出液の量と合っていないのかもしれない。
採血管に残った血液をPBSで洗って、もう一度抽出してみよう」
と言われました。
実際に、採血管に残っていた少量の血液を PBSで希釈して再抽出 すると、
A260/A280は約1.8まで改善 しました。
この時に大事だったのは、
抽出後のDNAを希釈したのではなく、検体を希釈して再抽出した
ことです。
つまり、細胞量に対して抽出条件が合っておらず、タンパク質などの不純物が十分に除去できていなかった可能性があります。
私はこの時、
「少なすぎるだけでなく、多すぎてもダメなことがある」
と初めて知りました。
実務メモ：検体によって純度の出やすさが違う
検体によって、DNAの純度の出やすさが異なることがあります。
例えば、顆粒球 はタンパク質や酵素成分が多いため、PBMCより A260/A280が低めに出る ことがあります。
一方、髄液 は細胞数が少ないため、DNA量自体が少なく、純度比だけでは判断しにくい ことがあります。
そのため、検体の種類も踏まえて結果を見ることが大切です。
A260/A280が高い原因（2.0以上）
純度は低いだけでなく、高すぎることもあります。
RNA混入
代表的な原因の一つが、RNA混入です。
RNAもDNAと同じ 核酸 のため、260nmの光を強く吸収します。
また、RNAは A260/A280が約2.0前後 になることが多いため、DNAサンプルにRNAが多く混ざると、A260/A280が高く出ることがあります。
RNAはDNA抽出時に、一緒に抽出されることがあります。
そのため、RNAを除去したい場合は、RNase（RNA分解酵素）を使って前処理することもあります。
純度比が不安定になる原因
① DNA量が少ないと数値が不安定になることがある
DNA濃度が低すぎる場合、純度比が不安定になることがあります。
これは、背景ノイズの影響を受けやすくなるためです。
特に、
- 髄液
- 少量検体
- 細胞数が少ない検体
では起こりやすいです。
数ng/µL程度では、純度比だけで判断しないこともあります。
② ブランク（Blank）が違う
意外とあるのが、Blankのミスです。
DNAをTE bufferで溶かしたのに、水でBlankを測定すると、値がズレることがあります。
基本は、DNAを溶かした液と同じ液でBlankを取ります。
DNA濃度もかなり重要
純度だけ良くても、実験がうまくいくとは限りません。
大事なのは、DNA濃度（ng/µL）です。
ただし、「濃ければ良い」というわけではありません。
実際には、PCRやシーケンスなど、次の実験条件に合うDNA量を入れる必要があります。
そのため、
- 濃すぎる場合は 希釈、
- 薄すぎる場合は 濃縮や再抽出
を検討することがあります。
例えばPCRでは、反応系に対してDNA量が多すぎると、不純物まで多く入り、増幅不良につながることがあります。
逆に少なすぎると、テンプレート不足で増えにくくなることがあります。
そのため現場では、
「どれくらいDNAがあるか」ではなく、
「反応系に対して適切な量か」
を見ることが大切です。
よくある濃度の目安
※施設条件や試薬条件によって異なります。
NanoDropで測定するときの注意点
原理的には、NanoDropは普通の分光光度計と違って、液滴（droplet）を上下の測定面で挟んで測るので、「最低限、液柱が安定して橋渡しできる量」が必要になります。
少なすぎると、
- 液が橋渡しできない
- 気泡が入る
- 測定が不安定
- 再現性悪化
が起こります。
逆に多すぎても、あふれたり、拭き取りが不十分になってコンタミの原因になります。
また、実務あるあるですが、量より“置き方”の方が数値に影響することが結構あります。
例えば、
❌ 先端を擦って置く
❌ 気泡が入る
❌ 真ん中に落ちていない
❌ 前のサンプル拭き残し
これらは意外とA260/A280がぶれる原因になります。
そのため濃度や純度がおかしいと思ったら、一度測り直すことも実務ではよくあります。
NanoDropの液量は機種により異なるので（1～2 µL程度が一般的）、施設の手順書に従うのが基本です。
実務メモ：採血管はすぐ捨てない
血液からDNAを抽出する場合、採血管をすぐ捨てないのもおすすめです。
採血管内のわずかな残血からも、DNAが取れることがあります。
再採血が難しい患者さんでは、大切な“保険”になります。
まとめ
DNA抽出後は、
- 濃度（どれくらいDNAが取れたか）
- 純度（どれくらい不純物が混ざっているか）
をセットで確認することが大切です。
純度では、
- A260/A280（タンパク質混入の目安）
- A260/A230（抽出試薬や塩類混入の目安）
を確認します。
一般的な目安は、
- A260/A280：約1.8
- A260/A230：約2.0
です。
ただし、「1.8ぴったりでなければ使えない」わけではありません。
実際の現場では、純度が少し低くても、
「とりあえずPCRにかけてみよう」
ということもあります。
逆に、数値がきれいでもうまく増幅しないこともあります。
そのため、大切なのは 数値だけに振り回されないこと です。
最終的には、PCRやシーケンスなど、次の実験に問題なく使えるDNAかが一番重要になります。
