5’と3’の詳しい化学構造を知らなくても、PCR操作そのものはできます。
ただ、プライマー設計やForward / Reverse primer、reverse complementを理解しようとすると、5’→3’という「DNAの向き」が何度も出てきます。
この記事では、PCR初心者が迷子にならないために必要な範囲にしぼって、5’と3’をやさしく整理します。
【結論】5’と3’は、DNAの「向き」を表す目印
5’（ファイブプライム）と3’（スリープライム）は、DNAを作る五炭糖の炭素番号に由来する、DNAの向きを表す目印です。
DNAの説明では、よく次のような表記が出てきます。
DNAが伸びるときは、伸びている鎖の3’OHに、次のヌクレオチドの5’リン酸がつながります。
そのため、DNAは5’→3’方向に伸びます。
PCRでも同じように、DNAポリメラーゼはプライマーの3’末端からDNAを伸ばします。
ヌクレオチドとは？
DNAの1単位は、塩基だけではありません。
A・T・G・Cという塩基に、五炭糖とリン酸がついたものをヌクレオチドと呼びます。
これがDNAの基本単位です。
五炭糖とは、炭素を5個もつ糖の総称です。
DNAに含まれる五炭糖はデオキシリボースと呼ばれます。
PCRで使う材料は、dATP、dTTP、dGTP、dCTPというdNTPです。
dNTPは、塩基・デオキシリボース・三リン酸がセットになった部品です。
つまりDNAは、塩基だけではなく、糖とリン酸を含むヌクレオチドを単位として作られています。
そして、5’→3’を理解するには、この五炭糖の構造を見ることが大切です。
5’と3’は、五炭糖の炭素番号に由来する
五炭糖には炭素が5個あり、それぞれに番号がついています。
この番号のうち、DNAの向きを考えるときに特に大事なのが、1’・5’・3’です。
構造式をすべて覚える必要はありません。
まずは、
1’：塩基がつく
5’：リン酸がつく
3’：次のヌクレオチドとつながるOHがある
と整理すると分かりやすくなります。
1’には塩基がつく
ヌクレオチドの構造のうち、１’につくのは塩基です。
塩基はA、T、C、Gがあり、この並び順がDNA配列として表されます。
遊離した五炭糖では1’側にもOHがあります。
しかし塩基が結合すると、このOHは外れ、1’炭素と塩基が結合します。
そのため、ヌクレオチドでは1’側に塩基がついている、と考えます。
5’にはリン酸がつく
遊離したデオキシリボースでは、5’炭素はCH₂OH（ヒドロキシメチル基）の形をしています。
つまり、5’炭素の先にはOHを含む部分があります。
ヌクレオチドになると、このOHのHが外れ、残ったOを介してリン酸が結合します。
ここでは、5’側にリン酸がつく例として、dATP の構造を示します。
dATP は、アデニン・デオキシリボース・リン酸3個からなるヌクレオチドで、PCRで使われる材料の1つです。
この図では、糖の5’側にリン酸が結合していること、そして3’側にOHが残っていることが分かります。
dATP では5’側にリン酸が3個ついていますが、重要なのは「5’側にリン酸が結合している」という点です。
また、ここは少し混乱しやすいところですが、「3’OHが大事」と聞くと、
でも5’にもOHがあるのでは？
と思うかもしれません。
糖だけを見れば、その通りです。
しかし、ヌクレオチドになると5’側のOHはリン酸と結合しているため、DNAが伸びるときに次をつなぐ手として残っているのは、3’末端のOHです。
3’OHに次のヌクレオチドの5’リン酸がつながる
3’側にもOHがあります。
ヌクレオチドになった後も、この3’OHは次のヌクレオチドとつながるための反応点として残ります。
DNAが伸びるときは、
伸びているDNA鎖の3’OH
＋
次のヌクレオチドの5’リン酸がつながります。
ここで注意したいのは、3’OHに「塩基そのもの」が直接つくわけではない、という点です。
新しいヌクレオチドには、すでに塩基・糖・リン酸がセットで含まれています。
3’OHにつながるのは、そのヌクレオチドの5’側のリン酸です。
つまり、
次のヌクレオチドの5’リン酸がつながる
↓
そのリン酸についた新しい糖もDNA鎖に入る
↓
その糖についている塩基も一緒に入る
というイメージです。
よく「DNAポリメラーゼが塩基をつなげる」と説明されることがあります。
しかし、これはかなり省略した表現です。
実際には、DNAポリメラーゼはdNTPを取り込み、伸びているDNA鎖の3’OHと、新しく入るヌクレオチドの5’リン酸との間に結合を作っています。
つながると「糖−リン酸−糖」の骨格になる
DNAというと、A・T・G・Cの塩基に注目しがちです。
しかし、DNAの骨格を作っているのは、塩基そのものではありません。
DNAの骨格は「糖−リン酸−糖−リン酸」でできています。
塩基は、糖から横に出ている部分です。
イメージとしては、次のようになります。
つまり、DNA鎖が伸びるとは、糖−リン酸の骨格が1ヌクレオチド分伸びるということです。
なお、プライマーを発注する際に使われる塩基配列では、糖やリン酸の骨格は共通なので省略され、塩基配列だけが表示されます。
たとえば、次のように表記されます。
5’ - GGCCAATGGCACCCAGTCTGAGAACAGCTGCA - 3’このように5’→3’の向きが書かれていれば、どちら側が5’末端で、どちら側が3’末端なのかが分かります。
二本鎖DNAは逆向きに並んでいる
DNAは二本鎖です。
ただし、2本の鎖は同じ向きではありません。
このように、片方が5’→3’方向なら、もう片方は3’→5’方向に並んでいます。
これを逆平行と呼びます。
PCRやプライマー設計では、この逆向きの関係がとても大事です。
なぜなら、Forward primerとReverse primerは、それぞれ反対側の鎖に結合し、
向かい合うようにDNAを伸ばすからです。
PCRではプライマーの3’末端から伸びる
PCRでも同じです。
DNAポリメラーゼは、プライマーの3’末端から新しいヌクレオチドをつなげていきます。
そのため、プライマー配列は5’→3’で書かれ、3’末端がとても重要になります。
PCRでは、プライマーの3’末端がDNA合成のスタート地点になります。
この考え方が分かると、Forward primer、Reverse primer、reverse complementの理解にもつながります。
まとめ
ヌクレオチドは、塩基・五炭糖・リン酸からできています。
五炭糖では、1’・5’・3’の位置が重要です。
1’：塩基がつく
5’：リン酸がつく
3’：OHがあり、次のヌクレオチドとつながるDNAが伸びるときは、伸びているDNA鎖の3’OHに、次のヌクレオチドの5’リン酸がつながります。
その結果、DNAは5’→3’方向に伸びます。
PCRでも同じように、DNAポリメラーゼはプライマーの3’末端からDNAを伸ばします。
つまり、
5’と3’はDNAの向き
3’OHが次をつなぐ手
DNAは5’→3’方向に伸びる
PCRではプライマーの3’末端がスタート地点と理解できれば十分です。
