PCRのプロトコールや試薬の取扱説明書には、反応に使用する試薬や濃度、添加量などを示した「反応液組成表」が記載されていることがあります。
この記事では、反応液組成表の見方と試薬の計算方法を解説します。
PCRに必要な材料
私が初めて分子生物学の実験をしたときは、反応液組成表を見ても、どれが何の試薬で、何のために使うのかもよく分かりませんでした。
まずは、PCR反応液に何が入っているのかを見てみましょう。
PCRで目的の領域のDNAを増幅するためには、基本的に次のような成分が必要です。
ただし、実際に使用する試薬の形は、製品やPCRの種類によって異なります。
例えば、BufferにあらかじめMg²⁺が含まれている製品もあります。
また、DNAポリメラーゼやdNTP、Bufferなど複数の成分があらかじめ混合されたMaster Mix（マスターミックス）やPremix（プレミックス）もあります。
プライマーも、Forward PrimerとReverse Primerをそれぞれ添加する場合もあれば、あらかじめ混合されたPrimer Mixを使用する場合があります。
さらに、リアルタイムPCR（qPCR）やddPCRでは、DNAの増幅を検出するために蛍光色素やプローブなどが加わる場合もあります。
そのため、実際の反応液の組成が必ずイラストと同じ形になっているとは限りません。
大切なのは、製品としてどのような形で用意されていても、PCR反応に必要な基本的な成分が何なのかを理解しておくことです。
【失敗談】Forward Primerを2回入れてしまった話
実は私自身、かつて反応液調製表のとおりに調製したつもりが、Reverse Primerを入れるところにも誤ってForward Primerを入れてしまったことがあります。
つまり、Forward Primerを2回入れ、Reverse Primerを入れていませんでした。
そのため、目的とするDNA領域は正常に増幅されませんでした。
当時は「表に書いてある試薬を間違えずに入れる」ことに精一杯でしたが、Forward PrimerとReverse Primerの両方がなぜ必要なのかを理解していれば、もう少し早く間違いに気づけたかもしれません。
反応溶液組成表は、単なる「入れる試薬の種類と量の一覧」ではありません。
どの試薬が何のために入っているのか、そして、その試薬がなければPCR反応にどのような影響があるのかを理解しておくことが大切です。
Template DNAとは？
Template DNA（鋳型DNA）とは、PCRで増幅するときにコピー元となるDNAです。
例えば、血液や細胞、組織などから抽出したDNAをPCRに使用する場合は、その「抽出したDNA」がTemplate DNAになります。
私自身、初めてPCRを行ったときは、「抽出したDNAをなぜ突然Template DNAと呼ぶの？」と混乱しました。
Templateとは「鋳型」という意味です。
つまり、DNAそのものの種類を表しているのではなく、PCRで「コピー元として使うDNA」という役割を表した呼び方です。
そのため、抽出DNAだけでなく、プラスミドDNAやPCR産物などを鋳型として使用する場合も、それらがTemplate DNAになります。
反応液組成表とは？
かつて先輩から、「実験が好きな人は料理も好き」と言われたことがあります。
その言葉を借りるとすれば、反応液組成表はPCR反応液を作るための「レシピ」です。
料理で言えば、
- 小麦粉 200 g
- 牛乳 150 mL
- 卵 1個
というレシピと同じです。
PCRでも、必要な試薬を決められた量だけ混ぜて反応液を作ります。
では、「何をどれだけ入れるか」は、どのように決まるのでしょうか。
使用するDNAポリメラーゼやPCRキットの取扱説明書には、各試薬の推奨量や最終濃度が示されています。
また、特定のプライマーセットを使用する場合には、その製品の取扱説明書やプロトコールに、PCR反応液の組成例が示されていることもあります。
反応溶液調製表は、こうした推奨条件をもとに、実際に使用する試薬の濃度から「何µL加えればよいのか」を計算して作成します。
PCR反応液の条件例
ここからは、下記のPCR反応液を例に、実際に必要な試薬の量をどのように計算すればよいのか見ていきます。
今回は、最終反応液量を25 µLとします。
| 試薬 | 原液濃度 | 最終濃度・必要量 |
|---|---|---|
| PCR Buffer | 10× | 1× |
| MgCl₂ | 25 mM | 1.5 mM |
| dNTP Mix | 2.5 mM each | 200 µM each |
| Forward Primer | 10 µM | 0.4 µM |
| Reverse Primer | 10 µM | 0.4 µM |
| DNA Polymerase | 2 U/µL | 0.5 U/reaction |
| Template DNA | 50 ng/µL | 50 ng/reaction |
| 滅菌水 | ― | ― |
※上記は、反応液の計算方法を説明するための一例です。実際のPCR条件は、使用するDNAポリメラーゼやPCRキットなどの取扱説明書・プロトコールに従ってください。
※MgCl₂は、PCR BufferやMaster Mixにあらかじめ含まれている製品もあります。その場合、別途MgCl₂を添加する必要はありません。
実際に添加量を計算してみよう
PCR反応液の調製表では、試薬によって添加量の求め方が異なります。
大きく分けると、「最終濃度から計算するもの」と「1反応あたりの必要量から計算するもの」があります。
今回は、次の3つに分けて計算してみます。
- Buffer、dNTP、Primer、MgCl₂など
- DNAポリメラーゼ
- Template DNA
それぞれ順番に見ていきましょう。
Buffer・dNTPなど最終濃度が決まっている試薬の場合
原液濃度と最終濃度が決められている試薬は、基本的に次の式で計算できます。
基本の希釈計算（Buffer・dNTPなど）
原液濃度 × 分取する量 ＝ 最終濃度 × 最終液量
C₁V₁ ＝ C₂V₂
分取する量をXとすると、
X ＝（最終濃度 × 最終液量）÷ 原液濃度
で求められます。
Bufferの場合
今回使用するBufferは原液が10×、反応液中の最終濃度が1×、最終液量が25 µLです。
10× × X µL ＝ 1× × 25 µL
したがって、
X ＝（1× × 25 µL）÷ 10×
＝ 2.5 µL
つまり、1反応あたり10× Bufferを2.5 µL添加します。
dNTPの「each」って？
dNTP Mixには、DNAの材料となるdATP・dTTP・dGTP・dCTPの4種類が含まれています。
「2.5 mM each」と書かれている場合は、4種類それぞれが2.5 mMずつ含まれているという意味です。
今回の最終濃度は200 µM eachですが、原液はmM、最終濃度はµMと単位が異なっています。
そのため、まず単位をそろえます。
1 mM ＝ 1000 µM
なので、
200 µM ＝ 0.2 mM
です。
あとは同じ式に当てはめます。
2.5 mM × X µL ＝ 0.2 mM × 25 µL
したがって、
X ＝（0.2 mM × 25 µL）÷ 2.5 mM
＝ 2.0 µL
つまり、1反応あたりdNTP Mixを2.0 µL添加します。
PrimerやMgCl₂など、原液濃度と最終濃度が決められている試薬についても、同じ方法で添加量を求めることができます。
DNAポリメラーゼの場合
DNAポリメラーゼは、濃度ではなく「1反応あたり何U使用するか」で指定されることがあります。
DNAポリメラーゼの添加量
必要な酵素量（U）÷ 酵素原液の濃度（U/µL）＝ 添加量（µL）
今回の例では、DNAポリメラーゼの原液濃度が2 U/µL、1反応あたりに必要な酵素量が0.5 Uなので、
0.5 U ÷ 2 U/µL ＝ 0.25 µL
となります。
したがって、1反応あたりDNAポリメラーゼを0.25 µL添加します。
DNAポリメラーゼも、考え方そのものは他の試薬と同じです。ただし、取扱説明書では「最終濃度」ではなく、「1反応あたり○U」という必要な酵素量で示されることがあります。そのため、必要な酵素量（U）を原液濃度（U/µL）で割れば、そのまま必要な添加量（µL）を求めることができます。
Template DNAの場合
Template DNAも、「1反応あたり何ngのDNAを入れるか」で指定されることがあります。
Template DNAの添加量
必要なDNA量（ng）÷ DNA原液濃度（ng/µL）＝ 添加量（µL）
今回の例では、DNA原液濃度が50 ng/µL、1反応あたりに必要なDNA量が50 ngなので、
50 ng ÷ 50 ng/µL ＝ 1 µL
となります。
したがって、1反応あたりTemplate DNAを1 µL添加します。
ここまで計算してきたように、PCR反応液を作るときは、
「最終濃度を合わせる試薬なのか」「1反応あたりに必要な量を入れる試薬なのか」
を最初に確認することがポイントです。
今回の条件から計算した添加量をまとめると、次のようになります。
| 試薬 | 原液濃度 | 最終濃度・必要量 | 計算式 | 添加量 |
|---|---|---|---|---|
| PCR Buffer | 10× | 1× | (1× × 25 µL) ÷ 10× | 2.5 µL |
| MgCl₂ | 25 mM | 1.5 mM | (1.5 mM × 25 µL) ÷ 25 mM | 1.5 µL |
| dNTP Mix | 2.5 mM each | 200 µM each | (0.2 mM × 25 µL) ÷ 2.5 mM | 2.0 µL |
| Forward Primer | 10 µM | 0.4 µM | (0.4 µM × 25 µL) ÷ 10 µM | 1.0 µL |
| Reverse Primer | 10 µM | 0.4 µM | (0.4 µM × 25 µL) ÷ 10 µM | 1.0 µL |
| DNA Polymerase | 2 U/µL | 0.5 U/reaction | 0.5 U ÷ 2 U/µL | 0.25 µL |
| Template DNA | 50 ng/µL | 50 ng/reaction | 50 ng ÷ 50 ng/µL | 1.0 µL |
| 滅菌水 | ― | ― | 25 − 9.25 | 15.75 µL |
| 合計 | ― | ― | ― | 25 µL |
もしもDNAが濃すぎたり、薄すぎたりしたら？
実際に抽出したDNAは、いつも同じ濃度になるわけではありません。
そのため、使用するプロトコールなどに合わせてDNA濃度を調整したり、PCR反応液に加えるTemplate DNAの量を変更したりすることがあります。
DNA濃度が高すぎる場合
DNA濃度が高すぎる場合は、滅菌水などで希釈してからPCRに使用します。
例えば、250 ng/µLのDNA原液を10 µL使用し、35 ng/µLに希釈する場合、加える水の量をX µLとすると、
250 × 10 ＝ 35 ×（10＋X）
となります。
これを計算すると、
X ≒ 61.4 µL
したがって、DNA原液10 µLに約61.4 µLの水を加えます。
これは、先ほど使用した C₁V₁＝C₂V₂ と同じ考え方です。
なお、現場では「何倍に希釈すればよいか」を先に求める方法も便利です。
250 ÷ 35 ≒ 7.1倍希釈
DNA原液を10 µL使用するなら、
10 × 7.1 ≒ 71 µL（希釈後の総液量）
なので、
71 − 10 ≒ 61 µL（水の添加量）
と考えることもできます。
DNA濃度が低すぎる場合
反対に、DNA濃度が低い場合は、PCR反応液に加えるTemplate DNAの体積を増やす方法があります。
例えば、1反応あたり50 ngのDNAが必要なのに、DNA原液が5 ng/µLだった場合、
50 ng ÷ 5 ng/µL ＝ 10 µL
となるため、50 ngのDNAを入れるためにはTemplate DNAを10 µL加える必要があります。
今回の反応液では、本来、
Template DNA：1 µL
滅菌水：15.75 µL
を加える設定でした。
しかし、Template DNAを1 µLから10 µLに増やすと、そのままでは反応液全体の体積が9 µL増えてしまいます。
そこで、Template DNAを増やした9 µL分だけ、滅菌水を減らします。
15.75 µL − 9 µL ＝ 6.75 µL
したがって、
Template DNA：10 µL
滅菌水：6.75 µL
とすれば、反応液の最終液量を25 µLに保つことができます。
つまり、Template DNAの添加量を変更するときは、増減した分だけ水の量を調整し、最終的な反応液量を一定にします。
ただし、DNA濃度が低ければ、その分だけTemplate DNAをたくさん入れればよい、というわけではありません。
Template DNAの添加量を増やすと、DNAと一緒に抽出液に含まれる成分も多く反応液へ持ち込むことになります。
抽出液には、塩類やEDTA、抽出方法によっては残留エタノールなど、PCRを阻害する可能性のある成分が含まれることがあります。また、Template DNA量が多すぎると、非特異的な増幅などにつながる場合もあります。
そのため、Template DNAの添加量を増やす場合には、使用するDNAポリメラーゼやPCRキットの推奨Template DNA量や添加可能な体積を確認することが大切です。
必要なDNA量を確保できない場合には、DNAの再抽出や濃縮などを検討することもあります。
複数検体を測定するときはどうする？
ここまでは、1反応（1チューブ）あたり25 µLのPCR反応液を作る場合について計算してきました。
しかし、実際の実験では複数の検体を同じ条件で測定することも多くあります。
例えば、10検体を同じ条件でPCRする場合を考えてみましょう。
このとき、すべての試薬を1チューブずつ量り取るのではなく、Template DNA以外の共通する試薬を必要な反応数分まとめて調製することができます。
これが**Master Mix（マスターミックス）**です。
実際の実験では、1反応あたりの添加量や反応数から、必要な試薬量をまとめた調製表を作っておくと便利です。
Master Mixは少し多めに作る
10反応行うからといって、Master Mixを10反応分ぴったり作ると、チューブやピペットチップに液が残り、最後のチューブに分注する量が足りなくなることがあります。
そのため、実際には分注ロスを考えて、必要量より少し多めにMaster Mixを作ります。
今回は計算例として4％余分に作り、10.4反応分として計算します。
10反応 × 1.04 ＝ 10.4反応分
各試薬の1反応あたりの添加量に10.4を掛けると、Master Mixに必要な量を求めることができます。
| 試薬 | 1反応あたり | 10.4反応分 |
|---|---|---|
| PCR Buffer | 2.5 µL | 26.0 µL |
| MgCl₂ | 1.5 µL | 15.6 µL |
| dNTP Mix | 2.0 µL | 20.8 µL |
| Forward Primer | 1.0 µL | 10.4 µL |
| Reverse Primer | 1.0 µL | 10.4 µL |
| DNA Polymerase | 0.25 µL | 2.6 µL |
| 滅菌水 | 15.75 µL | 163.8 µL |
| Master Mix合計 | 24.0 µL | 249.6 µL |
| Template DNA | 1.0 µL | 各1.0 µL |
| 最終液量 | 25.0 µL | 各25.0 µL |
例えばPCR Bufferなら、
2.5 µL × 10.4反応 ＝ 26.0 µL
DNAポリメラーゼなら、
0.25 µL × 10.4反応 ＝ 2.6 µL
となります。
同じように各試薬を計算してまとめて混合し、できあがったMaster Mixを1チューブあたり24 µLずつ分注します。
その後、それぞれのチューブに各検体のTemplate DNAを1 µLずつ加えれば、
Master Mix 24 µL ＋ Template DNA 1 µL ＝ 25 µL
となり、1反応分のPCR反応液が完成します。
余分に作る量が多ければ分注時に不足しにくくなりますが、その分だけ試薬の無駄も増えます。
そのため、分注時に不足しない量を確保しつつ、ピペットで量り取りやすく、試薬の無駄もできるだけ少なくなるように調製量を決めます。
※今回は計算方法を示すために4％余分に調製しています。実際にどの程度余分に作るかは、使用する試薬や反応数、分注量、施設のプロトコールなどに従ってください。
Excelで計算表を作っておくと便利
毎回すべての試薬量を電卓で計算する必要はありません。
実際の実験では、Excelなどで反応液の計算表をあらかじめ作っておくと便利です。
例えば、
- 各試薬の原液濃度
- 目的とする最終濃度・必要量
- 1反応あたりの添加量
- 必要な反応数
- 余剰分を含めた作製反応数
などを入力しておきます。
今回の例であれば、10反応に対して4％余分にMaster Mixを作るため、
10 × 1.04 ＝ 10.4反応分
とし、
1反応あたりの添加量 × 10.4
で各試薬の必要量が自動的に表示されるようにしておけば、毎回計算する手間を減らせます。
また、よく使用するPCR条件が複数ある場合には、原液濃度や最終濃度、添加量の組み合わせをあらかじめ表にしておくと便利です。
ただし、Excelが自動で計算してくれるからといって、表示された数字が必ず正しいとは限りません。
使用する試薬の製品や原液濃度、推奨条件などが変更された場合には、Excelの設定値や計算式も見直す必要があります。
そのため、最初に自分で計算方法を理解したうえで、Excelで自動化することが大切です。
まとめ
PCRの反応溶液調製表は、反応液を作るための「レシピ」です。
調製表を作るときは、
- 最終濃度が決まっている試薬：C₁V₁＝C₂V₂で計算する
- DNAポリメラーゼ：必要なUから添加量を計算する
- Template DNA：必要なDNA量と原液濃度から添加量を計算する
- 滅菌水：最終液量になるように調整する
- 複数反応：Master Mixを作り、反応数分まとめて調製する
という考え方が基本です。
実際の実験ではExcelなどで計算を自動化することもできますが、まずは調製表の数字がどのように決まっているのかを理解しておくことが大切です。
使用する試薬によって推奨条件は異なるため、実際に反応液を作る際には、DNAポリメラーゼやPCRキットなどの取扱説明書・プロトコールを確認しましょう。
