はじめに
フローサイトメトリー（FACS）では、細胞に存在する特定のタンパク質（抗原）を調べるために、蛍光標識抗体などを利用します。
ところが、実際の染色では、目的の抗体とは別に、目的の抗原を特異的に認識しない抗体を使用することがあります。
これが「アイソタイプコントロール」です。
しかし、ここで疑問が生まれます。
「目的の抗原を調べたいのに、なぜ別の抗体を使うの？」
「抗体を加えない未染色の細胞と比較するだけではダメなの？」
この記事では、アイソタイプコントロールの目的と原理、未染色コントロールやFMOコントロールとの違いを、初心者向けに解説します。
※厳密にはFACSは細胞を分取する技術を指しますが、本記事では一般的な呼び方に合わせ、蛍光を測定・解析するフローサイトメトリーについても「FACS」と表記します。
そもそもFACSのコントロールとは？
科学実験では、得られた結果を正しく解釈するために、比較の基準となるものを用意します。
これを「コントロール（対照）」と呼びます。
例えば、ある細胞に「タンパク質A」が存在するか調べたいとします。
タンパク質Aに結合する蛍光標識抗体（抗A抗体）を使用すれば、その結合を蛍光として検出できます。
しかし、蛍光が検出されたとしても、そのすべてがタンパク質Aへの特異的な抗体結合によるものとは限りません。
抗体が目的以外の場所に結合したり、細胞自体が蛍光を発したりすることもあるからです。
そこで、比較の基準となるコントロールを用意します。
FACSでは、何を確認したいかによって、使用するコントロールが異なります。
FACSで蛍光が出る＝目的の抗原がある、ではない
FACSでは、目的抗原そのものではなく、細胞から発せられる蛍光を測定しています。
蛍光には、目的抗原への特異的な抗体結合以外にも、
- 自家蛍光
- 抗体の非特異的結合
- 他の蛍光色素からの漏れ込み
など、さまざまな原因があります。
これらの仕組みについては、別記事「フローサイトメトリーの「陰性」とは？蛍光陰性でも細胞が表示される理由」で詳しく解説しています。
ここで重要なのは、蛍光が検出されたことと、目的抗原への特異的結合が確認されたことは同じではないという点です。
未染色コントロールではダメなの？
① 未染色コントロールとは？
未染色コントロールとは、蛍光標識抗体などで染色していない細胞試料のことです。
未染色の細胞でも、自家蛍光などによってシグナルが検出されることがあります。
そのため、未染色コントロールを測定すると、抗体を加えていない状態で、どの程度の蛍光が生じるのかを確認できます。
② 未染色では抗体による背景染色がわからない
例えば、抗A抗体で染色した細胞の蛍光が、未染色の細胞よりも強かったとします。
しかし、その差がすべてタンパク質Aへの特異的な結合によるものとは限りません。
抗A抗体が目的以外の場所に結合したことによる蛍光も含まれている可能性があるからです。
つまり、未染色コントロールだけでは、抗体を加えることによって生じる背景染色を十分に評価できないのです。
そこで使用される対照の一つが、アイソタイプコントロールです。
アイソタイプコントロールとは？
① そもそもアイソタイプとは何か？
アイソタイプとは、抗体の定常領域の違いによって区別される抗体の種類（型）のことです。
少し難しいので、まずは抗体の種類と構造から順番に見ていきましょう。
抗体（免疫グロブリン）には、IgG、IgM、IgA、IgE、IgDという5つの大きな種類があります。
これらを抗体の「クラス」と呼びます。
さらに、同じクラスの中にも、細かく分類される仲間がいます。
例えば、ヒトのIgGには、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4という4つの種類があります。
これらを「サブクラス」と呼びます。
家族に例えるなら、IgGやIgMなどが大きなグループで、IgG1やIgG2などは、同じグループに属する兄弟のようなものです。
では、何を基準に分類しているのでしょうか？
その答えを理解するために、抗体の構造を簡単に見てみましょう。
抗体は、基本的にY字型の構造を持つタンパク質です。
Y字の先端には、抗原を認識して結合する部分があります。この部分を構成するのが「可変領域」です。
一方、抗体には「定常領域」と呼ばれる部分もあります。
定常領域は、クラスやサブクラスによってアミノ酸の配列や構造が異なります。
このような定常領域の違いによって区別される抗体の種類を「アイソタイプ」と呼びます。
つまり、IgGやIgMといったクラス、IgG1やIgG2といったサブクラスは、アイソタイプの分類に含まれます。
例えば、目的抗体がマウス由来のIgG1であれば、アイソタイプコントロールにも、一般に同じマウスIgG1の抗体を使用します。
② なぜ同じ種類の抗体を使うのか？
目的抗体とアイソタイプコントロールは、細胞のどこに結合するのでしょうか？
まず、目的抗体は、Y字の先端にある可変領域で、目的の抗原を特異的に認識して結合します。
しかし、抗体は目的抗原以外の場所にも結合することがあります。
例えば、Y字の根元にある「Fc領域」が、細胞表面の「Fc受容体」に結合する場合があります。
つまり、目的抗体による蛍光には、目的抗原への特異的な結合だけでなく、それ以外の結合による蛍光も含まれる可能性があるのです。
では、アイソタイプコントロールはどうでしょうか？
アイソタイプコントロールは、目的抗原を特異的に認識しないように選ばれた抗体です。
しかし、目的抗体と同じように、Fc受容体などに結合することがあります。
アイソタイプコントロールにも蛍光色素が付いているため、細胞に結合すれば蛍光が検出されます。
そこで、目的抗体と同じ動物種・アイソタイプの対照抗体を使用します。
Fc領域などの性質をできるだけそろえ、目的抗原への特異的な結合とは無関係に生じる背景染色を評価するためです。
このような対照抗体を「アイソタイプコントロール」と呼びます。
ただし、同じアイソタイプでも抗体ごとの性質は完全には一致しないため、目的抗体の非特異的結合をすべて再現できるわけではありません。
なお、Fc受容体への結合による背景染色が問題となる場合には、Fc受容体ブロッキング剤を使用して、結合を抑える方法もあります。
③ アイソタイプコントロールには何を使用する？
一般に、目的抗体と次のような条件をできるだけそろえた対照抗体を選びます。
- 抗体を作製した動物種
- 抗体のアイソタイプ・サブクラス
- 蛍光標識の種類
- 使用する抗体量や濃度などの染色条件
例えば、目的抗体がマウスIgG1で、蛍光色素PEが結合している場合には、適切なマウスIgG1-PEのアイソタイプ対照抗体を選びます。
蛍光色素の種類をそろえるのは、蛍光色素による明るさや検出条件の違いをできるだけ減らすためです。
ただし、同じアイソタイプであっても、抗体の可変領域や蛍光標識の程度などは異なる場合があります。
そのため、条件をそろえても、目的抗体と完全に同じ背景染色を再現できるわけではありません。
また、抗体量や濃度は、単純に同じ液量を加えればよいというものではなく、使用する抗体の性質や染色条件に応じて検討する必要があります。
アイソタイプコントロールで何がわかるのか？
① 目的抗体と対照抗体の染色を比較する
ここでは、タンパク質Aを調べる場合を考えてみましょう。
同じ細胞試料を2本のチューブに分け、それぞれ次のように染色します。
| チューブ① | チューブ② | |
|---|---|---|
| 使用する抗体 | 抗A抗体 | アイソタイプ対照抗体 |
| タンパク質Aへの特異的結合 | 起こり得る | 起こらないように選択する |
| 目的抗原とは無関係な結合 | 起こる可能性がある | 起こる可能性がある |
| 蛍光の測定 | 行う | 行う |
チューブ①では、目的抗体による染色を調べます。
チューブ②では、目的抗原を認識しない対照抗体による背景染色が、どの程度見られるのかを確認します。
この2つの結果を比較することで、目的抗体による染色結果を解釈するための手がかりが得られます。
② ヒストグラムでは何を比較する？
FACSでは、細胞の蛍光強度をヒストグラムで表示することがあります。
一般に、横軸は蛍光強度、縦軸は細胞数または相対的な頻度を表します。
例えば、目的抗体で染色した細胞の蛍光分布が、アイソタイプコントロールよりも右側に移動していた（蛍光強度が高かった）とします。
この場合、目的抗体による染色の方が、対照抗体による染色よりも強いことがわかります。
これは、目的抗原への特異的な結合が生じている可能性を考える手がかりになります。
一方、両者の蛍光分布がほとんど重なっている場合には、目的抗体による染色を背景染色から明確に区別できない可能性があります。
ただし、目的抗原がまったく発現していないと断定することはできません。
③ 蛍光の差を単純に引き算してよい？
アイソタイプコントロールは、背景シグナルを評価するための対照ですが、目的抗体の蛍光強度からアイソタイプコントロールの蛍光強度を単純に差し引くためのものではありません。
例えば、目的抗体の蛍光強度が100、アイソタイプ対照の蛍光強度が30だったとしても、
100 − 30 ＝ 70
という計算によって、目的抗原への特異的結合に由来する蛍光強度が70であると断定することはできません。
目的抗体と対照抗体では、非特異的結合の性質が異なる可能性があるためです。
アイソタイプコントロールで陽性・陰性を決めてよい？
アイソタイプコントロールは、対照抗体による背景シグナルを評価するためのものです。
しかし、アイソタイプコントロールを陽性・陰性の境界（ゲート）の設定に使用することは、原則として推奨されません。
目的抗体とアイソタイプ対照抗体では、非特異的結合の性質が完全には一致しないためです。
特に多色フローサイトメトリーでは、他の蛍光色素からの漏れ込みや、蛍光補正後の分布の広がりも影響します。
そのため、ゲート設定にはFMOコントロールや適切な生物学的陰性対照などを利用し、目的や測定条件に応じて判断します。
アイソタイプコントロールとFMOコントロールの違い
FMOとは、Fluorescence Minus Oneの略です。
FMOコントロールは、多色染色で使用する蛍光標識抗体のうち、調べたい蛍光パラメータに対応する抗体だけを除き、それ以外の抗体を加えて染色した対照です。
例えば、抗A抗体、抗B抗体、抗C抗体を、それぞれ異なる蛍光色素で標識して使用するとします。
抗B抗体に対応するFMOコントロールでは、抗A抗体と抗C抗体を加え、抗B抗体だけを除きます。
これによって、抗B抗体を入れていない状態でも、Bの測定チャンネルにどの程度のシグナルや分布の広がりが生じるのかを確認できます。
FMOコントロールは、特に弱陽性集団と陰性集団の境界を判断する際に役立ちます。
| 比較項目 | アイソタイプコントロール | FMOコントロール |
|---|---|---|
| 操作 | 目的抗体を対照抗体に置き換える | 対象の蛍光標識抗体を除く |
| 主な目的 | 対照抗体による背景シグナルの評価 | 多色染色での陰性分布やゲート設定の評価 |
| 特に注目すること | 非特異的結合など | 他の蛍光色素からの漏れ込みや分布の広がり |
| 限界 | 目的抗体の非特異的結合を完全には再現しない | 除いた目的抗体の非特異的結合は評価できない |
つまり、両者は似たような対照に見えても、調べている内容が異なります。
FACSにはほかにどんなコントロールがある？
FACSでは、アイソタイプコントロール以外にも、さまざまな対照が使用されます。
| コントロール | 主な目的 |
|---|---|
| 未染色コントロール | 細胞の自家蛍光などを確認する |
| 単染色コントロール | 蛍光の漏れ込みを評価し、補正に利用する |
| アイソタイプコントロール | 対照抗体による背景シグナルを評価する |
| FMOコントロール | 多色染色で陰性分布を確認し、ゲート設定に役立てる |
| 生物学的陰性対照 | 目的抗原を発現しない細胞などを用いて染色結果を評価する |
| 生物学的陽性対照 | 目的抗原を発現する細胞などを用いて検出できることを確認する |
なお、アイソタイプコントロールは、すべてのFACS検査で必ず使用するものではありません。
使用する抗体、目的とする細胞集団、染色条件、解析方法によって、必要な対照は異なります。
大切なのは、何を確認するためのコントロールなのかを理解し、その目的に合った対照を選ぶことです。
まとめ
アイソタイプコントロールは、FACSにおいて、目的抗体による染色結果を解釈するために使用される対照の一つです。
今回のポイントを整理します。
- FACSでは、目的抗原そのものではなく、蛍光を検出している。
- 抗体は目的抗原以外にも結合することがあり、背景シグナルが生じる場合がある。
- 未染色コントロールでは、自家蛍光などを確認できる。
- アイソタイプコントロールでは、目的抗体の代わりに、目的抗原を特異的に認識しない適切な対照抗体を使用する。
- 目的抗体と対照抗体の染色結果を比較することで、背景シグナルを評価する手がかりが得られる。
- ただし、アイソタイプコントロールだけで特異的結合や陽性・陰性を確定できるわけではない。
- FMOコントロールなど、他の対照とは目的が異なる。
FACSのコントロールは、一見すると複雑に感じられます。
しかし、「何を調べたいのか」「何と比較するのか」「その比較によって何がわかるのか」を順番に整理すると、それぞれの操作の意味が見えてきます。
アイソタイプコントロールも、単に目的抗体の代わりに別の抗体を入れる操作ではありません。
目的抗体による染色結果を、より適切に解釈するための対照実験なのです。
参考資料
- Bio-Rad Laboratories：Controls for Flow Cytometry
- Bio-Rad Laboratories：Isotype Controls for Flow Cytometry
- Bio-Rad Laboratories：Fluorescence Minus One (FMO) Controls
